ZFN

Que sont les nucléases à doigts de zinc

  • La séquence d’ADN est reconnue par une protéine. Le domaine « à doigts de zinc » (en anglais, Zinc Finger, ZF) reconnaît une séquence d’ADN particulière.
  • Plusieurs domaines à doigts de zinc sont fusionnés c’est-à-dire collés bout-à-bout pour lier le gène cible. Le domaine de liaison à l’ADN est donc artificiellement construit avec des protéines à doigts de zinc.
  • Le domaine de reconnaissance de l’ADN est fusionné à un ciseau moléculaire, une nucléase (N). Cette protéine de fusion est appelée ZFN et reconnaît une séquence d’ADN et la coupe. ZFN est donc un assemblage de plusieurs protéines pour obtenir une machine qui reconnaît et coupe l’ADN à un endroit choisi.
  • Fusionner/Coller tous ces domaines de protéines ensemble et vérifier leur spécificité prend du temps et est très complexe.
  • Malgré tout, ZFN est le plus petit de tous les ciseaux à gène connus

Comme pour d'autres méthodes d'édition de génomes, les protéines de fusion ZFN sont utilisées pour modifier spécifiquement un gène en insérant, enlevant ou remplaçant certaines sections d'ADN.
Pour trancher l’ADN, deux modules ZFN doivent se placé de chaque côté de la séquence d’ADN cible - les ZFN s'arrimant en diagonale face à face sur le double brin d'ADN. Ce mode de coupure n’est pas toujours effectif et, même en conditions optimales, la réparation du gène coupé en diagonale active deux mécanismes de réparation de l’ADN différents, ce qui donne lieu à une série de résultats possibles.

Trois types de modifications sont possibles par la méthode ZFN:
ZFN-1: la coupure est petite et induit des trous, de petites altérations aléatoires de l'ADN à un gène spécifique. La cellule rebouche les trous de façon plus ou moins aléatoire, en utilisant un mécanisme de réparation appelé "NHEJ" (recombinaison non-homologue). Les changements peuvent être des petites délétions, substitutions ou insertions de nucléotides.
ZFN-2: la coupure est petite et la réparation est effectuée selon les instructions contenue sur brin de matrice d'ADN qui a été introduit artificiellement. Ce brin d'ADN est homologue, il a presque la même séquence que la région cible, mais avec une ou deux modifications mineures ou une courte insertion. Par conséquent, le gène coupé sera réparé avec les modifications contenues dans les instructions par recombinaison homologue.
ZFN-3: la coupure est plus importante et la réparation est effectuée selon les instructions contenue sur brin de matrice d'ADN qui a été introduit artificiellement. Dans ce cas, le brin d’ADN matrice contient une séquence d'ADN longue additionnelle et permet, par exemple, d’insérer un gène de résistance.

La production d’une plante génétiquement modifiée par ZFN se fait en plusieurs étapes :

  • La séquence d’ADN codant pour la protéine de fusion ZFN est d’abord intégrée au génome de la plante au moyen de procédés de génie génétique standard, ce qui en fait de cette plante un OGM.
  • Le ciseau moléculaire ZFN modifie le génome de la plante. Les plantes modifiées selon le résultat voulu sont sélectionnées
  • La séquence codant pour ZFN doit être éliminée par croisement et sélection. Ceci est possible si la séquence à modifier et l’insertion de la séquence ZFN sont suffisamment éloignées dans le génome. Par rapport aux techniques, moins d’ADN étranger subsiste dans le produit OGM final. Les plantes produites par ZFN restent des OGM.

Applications commerciales
ZFN-1,2: La perte, l'altération ou l'insertion d'un seul nucléotide (mutation ponctuelle) peut être suffisante pour modifier certaines caractéristiques d'une plante, par exemple, sa tolérance aux herbicides, induire la stérilité mâle ou femelle, modifier la couleur de la fleur, obtenir une maturation tardive des fruits.
ZFN 3 : introduire un gène de résistance

Problèmes

  • Imprécision: les domaines ZF changent de spécificité lorsqu’ils sont mis bout-à-bout. La protéine de fusion ZFN finale qui contient plusieurs domaines ZF reconnaît donc souvent plusieurs séquences d’ADN possibles, ce qui entraîne une quantité importante de mutations indésirables dans le génome.
  • Dans le cas de ZFN-2 & -3, il est possible que la matrice d'ADN ajoutée soit intégrée dans le génome au hasard - en tout ou en partie - comme c'est le cas pour les insertions transgéniques. Ces insertions peuvent détruire des gènes et des séquences régulatrices et, donc, avoir des effets incontrôlés sur la plante produite.
  • Les procédés de transformation et de transfection, y compris la culture tissulaire, sont utilisés pour la production de plantes génétiquement modifiées par ZFN. De tels processus conduisent à d'autres mutations.

Conclusion

Les trois variantes de la ZFN ont pour but d'introduire des modifications ciblées dans le matériel génétique et de changer les caractéristiques d'un organisme. Tous trois sont sensibles aux effets indésirables, à la fois en raison de l'activité du ZFN et des effets des processus de génie génétique, qui conduisent généralement à des centaines de mutations et d'effets indésirables. En dehors de cela, les mécanismes de réparation des plantes ne font pas l'objet de recherches concluantes, ce qui donne lieu à des incertitudes supplémentaires. Les plantes modifiés par les ZFN sont classées comme OGM et nécessitent une évaluation complète des risques.

Source: „Neuen Züchtungstechniken“ (NZT). Inhärente Risiken und Regulierungsbedarf. Dr. Ricarda A. Steinbrecher. EcoNexus, Briefing, Dezember 2015, S. 2-3